Giovanni
Es el protagonista de la obra, hijo de Florio y hermano de Anabella. Giovanni mantiene un vínculo incestuoso con su hermana a escondidas de la gente. A pesar de las advertencias que recibe del fraile, está convencido de que su amor es puro y bueno, y nada de malo puede haber en la unión de dos personas que se aman. Al final de la obra, Giovanni mata a su hermana para liberarla del matrimonio con Soranzo y proteger su honor. Luego, mata también a Soranzo y termina muriendo tras el ataque de un grupo de mercenarios ordenado por Vasques.
Anabella
Se trata de la hermana de Giovanni y a quien refiere el título de la obra. Anabella es una joven con un futuro prometedor: proviene de una buena familia, tiene dinero y es bella. Por eso, muchos hombres se disputan su amor, aunque ella no está interesada en ninguno de ellos, porque ama a su hermano. Así, cuando Giovanni le declara su amor, Anabella corresponde a sus sentimientos y ambos inician una relación a escondidas. Pronto, Anabella queda embarazada y, para proteger a su hermano, decide casarse con Soranzo. Sin embargo, su prometido descubre todos sus secretos y la mantiene encerrada. Anabella intenta advertir a su hermano de los peligros que los acechan y Giovanni termina apuñalándola para salvarla del infierno que será su matrimonio.
Florio
Es un noble respetado de Parma, padre de Giovanni y Anabella. Florio es un hombre liberal, que deja en manos de su hija la elección de su esposo. Sin embargo, cuando la muchacha enferma y el médico dice que la cura es el casamiento, interviene para propiciar el matrimonio entre ella y Soranzo. En el último acto, Florio muere al ver a Giovanni con el corazón de su hermana clavado en una daga y escuchar la confesión sobre la relación incestuosa que este mantenía con ella.
Putana
Es la nodriza de Anabella y sabe desde el primer momento que la joven mantiene un amorío con su hermano. También, es la primera en detectar que Anabella está embarazada. Putana revela el secreto de los hermanos a Vasques, el criado de Soranzo, quien le promete que no recibirá ningún castigo por aquella confesión. Acto seguido, el hombre la encierra y manda a sus secuaces a que le quiten los ojos. Al final de la obra, Putana es incinerada públicamente por orden del Cardenal, acusada de ser cómplice del incesto entre los hermanos.
El fraile
Se trata de un sacerdote de la iglesia católica que aconseja a los hijos de Florio para que abandonen su vínculo incestuoso. En un principio, su influencia sobre los jóvenes es nula; sin embargo, con el paso del tiempo atemoriza a Anabella con la idea del infierno y logra que ella se arrepienta genuinamente de sus actos.
El Cardenal
Se trata de un poderoso representante de la Iglesia Católica. El Cardenal condena al exilio a Grimaldi por el asesinato de Bergetto y luego actúa de la misma manera con Vasques, quien participa del asesinato de Giovanni.
Bergetto
Se trata del sobrino de Donado. Es un hombre poco inteligente que quiere comprometerse con Anabella, aunque tiempo después se olvida de ella, cuando conoce a Filotis. Justo antes de casarse con Filotis, Bergetto es asesinado por Grimaldi, quien lo confunde con Soranzo.
Donado
Se trata del tío de Bergetto. Donado es un hombre inteligente que intenta que su sobrino se case con la codiciada Anabella. Consciente de las limitaciones intelectuales de su sobrino, se encarga él mismo de realizar el cortejo. Sin embargo, sus esfuerzos son inútiles, puesto que Anabella no está interesada en Bergetto y, además, su sobrino se olvida de Anabella cuando conoce a Filotis.
Grimaldi
Es un caballero romano que está profundamente enamorado de Anabella. Al inicio de la obra, pierde en un duelo contra Vasques, quien combate en nombre de su amo. Por eso, se complota con Ricardetto para destruir a Soranzo y se prepara para apuñalarlo con una espada envenenada. Sin embargo, Grimaldi comete una equivocación y termina por asesinar a Bergetto. Inmediatamente, el caballero romano se dirige al Cardenal y se pone bajo su protección. Este, en vez de castigarlo como corresponde, lo envía de regreso a Roma.
Hipólita
Es la mujer de Ricardetto. Hipólita le es infiel a su esposo con Soranzo, y este último le promete casarse con ella cuando enviude. Luego de la supuesta muerte de su esposo, Hipólita va en busca de Soranzo, pero descubre que él no está interesado en ella y que no va a cumplir con su promesa. Por tal motivo, trama una venganza contra él y planea envenenarlo durante su casamiento con Anabella. Al final, es Hipólita es quien muere envenenada, tras ser traicionada por Vasques, quien todo el tiempo simula ser su aliado.
Ricardetto
Es el esposo de Hipólita y el tío de Filotis. Ricarrdetto finge su muerte y se disfraza de médico para averiguar con quién le es infiel su esposa. Luego de descubrir que se trata de Soranzo, Ricardetto planea vengarse. Para ello, le da un veneno a Grimaldi, pero accidentalmente eso deriva en la muerte de Bergetto.
Filotis
Es la sobrina de Ricardetto, que acompaña a su tío y lo ayuda —sin saberlo— en su objetivo de vengar la infidelidad de su esposa. Filotis se va a casar con Bergetto, aunque este es asesinado cuando se está por realizar la unión. Por orden de su tío, Filotis termina en un convento.
Soranzo
Es el principal pretendiente de Anabella. De todos los hombres que compiten por ella, Soranzo es el de mejor reputación. Sin embargo, mientras intenta cortejarla, aparece Hipólita, una mujer casada a la que tiempo atrás sedujo y hasta prometió matrimonio, en caso de que ella enviudara. Soranzo escucha indiferente los reclamos de Hipólita, quien ya viuda le demanda que cumpla con su palabra. Finalmente, Soranzo consigue casarse con Anabella, aunque pronto descubre que ella está embarazada de su hermano, por lo que elucubra una terrible venganza contra ambos. En el último acto, antes de lograr su cometido, Soranzo es asesinado por Giovanni.
Vasques
Se trata del criado de Soranzo. Durante toda la obra, Vasques vela por los intereses de su amo con mucha sagacidad. Es así que traiciona a Hipólita para salvar la vida de Soranzo y, también, descubre con quien mantiene relaciones sexuales Anabella. Sin embargo, Vasques falla en su objetivo principal cuando Giovanni le quita la vida a Soranzo. Ante esta situación, ordena a sus mercenarios contratados que maten al joven.
Poggio
Es el criado de Bergetto y acompaña a su amo en todas sus actividades.
Los mercenarios
Es un grupo de asesinos a sueldo que contrata Vasques en dos oportunidades. Los mercenarios se encargan de mutilar y mantener capturada a Putana, y luego, en el acto final, de matar a Giovanni.
