La acción tiene lugar en la hacienda que aportó al matrimonio la primera mujer de Serebriakov. En ella residen su hija, Sonia, el tío Vania, Teleguin (amigo de la familia), María (madre de Vania), la nana Marina y un mozo. Acababan de llegar a residir en ella los esposos terratenientes: el profesor Serebriakov y la hermosa Elena, su segunda esposa con quien Sonia nunca tuvo buena relación. En la hacienda llevaban una vida de campo tranquila y llena de duro trabajo. Las ganancias de la finca eran enviadas a Serebriakov, que vivía en la ciudad junto con su esposa. Él era un crítico de arte y profesor de una cátedra pero al jubilarse decide mudarse a la finca debido a la poca renta que la finca producía.
Serebriakov escribía artículos de crítica de arte que encantaban al tío Vania y a su madre, por lo que Vania acepta dedicar su vida a administrar la finca de Serebriakov. Pero cuando llega a la hacienda Serebriakov, Vania se percata de que este es un verdadero fracasado. Esto causa a Vania una gran desolación, al reparar que ha "gastado" su propia vida en auxiliar a su fatuo cuñado y, por si fuera poco, se halla atraído por su esposa, Elena.
A la finca llega Ástrov, el médico de la región que además es íntimo amigo del tío Vania desde hace por lo menos diez años. Ástrov llega a atender a Serebriakov, quien insiste en sufrir reuma a pesar de haber sido diagnosticado con gota. Ástrov queda prendado de Elena y sus visitas se vuelven cada vez más constantes, revelándose que Elena se siente frustrada de su esposo, aunque siente que su "deber" es acompañarlo hasta la muerte, pese haber sacrificado su juventud y belleza a un hombre fracasado que solo vive de apariencias. Sonia está enamorada de Ástrov desde hace seis años y nunca se ha atrevido a decírselo. Le gusta de él que es un hombre inteligente, que planta bosques y que está absolutamente comprometido con su trabajo.
Todo el ambiente ahí es muy tenso debido a que la vida cotidiana de los que vivían ahí ha sido del todo modificada. Desde la llegada de Serebriakov y Elena todo en la hacienda se mueve en torno a ellos, se desplazan horarios de comida y de sueño, se bebe alcohol todo el día y nadie trabaja más que Sonia.
Una noche una tormenta cae sobre la hacienda y la electricidad se corta tras la caída de un rayo. Esto retiene al doctor Ástrov y lo obliga a pasar la noche ahí. Teleguin, Vania y Ástrov beben hasta emborracharse. El tío Vania, ya ebrio, busca a Elena e intenta besarla pero ella lo rechaza rotundamente dejándolo destrozado. Sonia lo encuentra así y lo regaña por haber bebido. Vania se marcha y Sonia busca a Ástrov para pedirle que no permita que su tío beba. Después de darle de cenar, Sonia confiesa indirectamente su amor pero Ástrov no repara en ello y se marcha. Sonia queda triste y sintiéndose ridícula cuando aparece Elena, con quien hace las paces, luego Sonia le confiesa su amor por Ástrov y lo mucho que la aflige no ser bella. Elena le da ánimo y la alienta a no rendirse, aunque confiesa que a ella también le atrae Ástrov.
Al comienzo del tercer acto Sonia le pide ayuda a Elena para saber cuáles son los sentimientos de Ástrov. Elena finge estar interesada en los planos cartográficos que Ástrov se entretiene haciendo y cuando él se los está mostrando le pregunta si él ama a Sonia. Ástrov contesta que no y Elena le pide entonces que no vuelva por la hacienda, pero Ástrov, que nota a Elena atraída por él, la acorrala y la besa. En ese momento entra Vania que había salido a buscar unas rosas de otoño que le regalaría a Elena. Al verse sorprendidos, Ástrov se comporta casual y hasta habla del clima y sale, pero Elena le dice a Vania que ella y su marido se marcharán de ahí ese mismo día; Vania le dice que lo vio todo pero que no le importa y ella insiste en rechazarlo.
Los ánimos se crispan todavía más cuando Serebriakov reúne a la familia y propone vender la hacienda e invertir el dinero en papeles del Estado y con el sobrante comprar otra finca en Finlandia para vivir allí solo con Elena. Tío Vania toma tal propuesta como una afrenta, recriminando que dónde iban a vivir él, su madre y Sonia, que la hacienda surgió de la dote que le dieron a la primera esposa de Serebriakov, su hermana, y que incluso Vania mismo había aportado de su propio capital y saldado las cuentas, amén de su trabajo por más de veinticinco años renunciando a sus propios sueños. Le recrimina también su fracaso como crítico de arte y lo culpa de la pobreza de la finca, debido a que todo el dinero se lo enviaban a él. La discusión acaba con un tío Vania furioso que dispara en dos ocasiones a su cuñado, errando ambos tiros.
En el último acto Ástrov le pide a Vania que le devuelva un frasco de morfina que le ha robado con el propósito de suicidarse y que mejor se pegue un tiro en el bosque. Serebriakov y Elena se van de la hacienda y Vania arrepentido hace las paces con él y le promete seguir enviándole dinero, mientras Serebriakov renuncia a vender la finca. Ástrov promete a Elena no regresar a la hacienda por el bien de Sonia y ella le agradece el afecto mostrado, prometiendo recordarlo. La obra termina con un Vania y una Sonia desconsolados que se prometen mutuamente trabajar con esfuerzo hasta que al fin llegue su momento de descanso.
